日干鲁女I在线免费观看视频一区I一区二区三区四区在线免费观看I日韩人妻无码AVI99热这里有精品首页8I四虎AV无码I久久国产网I免费高清看电视网站I一区在线播放

 實驗室在進行血清抗體檢測時，尤其是在疫情發生情況下，必須采取一些措施防止操作人員感染NiV。血清可以用伽馬射線（6kGy）照射或者用含有0．5％tween-20和0．5％的triton-X100的PBS稀釋后56~0作用30min進行病毒滅活。

（1）VNT法檢測血清抗體。VNT法檢測血清抗體采用引起50％細胞培養孔發生CPE的TCID5。判定法。將待測血清和標準NiV病毒液作用后再加到含有Vero細胞的96孔板中，3天后進行觀察。CPE被*抑制的孔判為陽性孔。血清從1：2開始稀釋進行檢測。由于血清本身也會引起CPE，如果血清本身CPE干擾性太強，可以先讓待測血清和標準的病毒液在37~C作用10rain，然后將此混合液和細胞在37~C作用45min，再傾去此混合液，以減輕血清本身CPE的干擾。對于質量不好的血清，或者量少的血清（如蝙蝠等動物的血清）可以從1：5開始稀釋。
被檢血清在10倍以上稀釋時能夠*抑止CPE，判定為陽性；被檢血清在2-10倍之間稀釋時能夠*抑止CPE的，判為疑似；其他情況判為陰性。

（2）ELISA法檢測血清抗體。血清中抗NiV抗體ELISA檢測所用的抗原一般用NiV感染的Vero細胞制備，有些血清樣品用此抗原檢測背景值很高，須用正常Vero細胞裂解液作為對照抗原，檢測這些血清的背景值，zui終以檢測值和背景值的比值作為判定依據。國家外來動物疫病診斷中心和AAHL合作，利用大腸桿菌表達的病毒N蛋白和P蛋白也建立了抗NiV血清抗體檢測技術，其步驟和AAHL與馬來西亞獸醫研究所合作開發的NiV間接ELISA抗體檢測的步驟*相似。

①血清處理。實驗人員必須穿防護服和手套，并且在將該密封板從*拿到外面在56~C加熱30rain之前，消毒他們的雙手和密封的板。在*里，在96孔板的孔上用含有0．5％（體積分數）triton X-100和0。5％（體積分數）tween-20的PBS按照1：5比例稀釋被測血清。密封此96孔板。然后，每份滅活的血清樣品取22．5PI+和用PBS稀釋100倍的對照抗原進行等體積*混合，并在18-22~C作用30min。然后，每份血清樣品加入405~tL封閉液（含有5％的卵清蛋白和5％的脫脂牛奶）使血清zui終稀釋100倍，在18～22尼帕病毒病作用30min，在兩個用NiV抗原包被的孔和在另外兩個用對照抗原包被的孔中分別都加入100ul這樣稀釋的待測血清。

②包被抗原。用PBS稀釋對照抗原和NiV抗原，要確保這兩種抗原蛋白質濃度相同。抗原通常稀釋到l／4000-1／1000。但對每一批抗原，都應確定其合適的稀釋度。按照下面方法向NUNCMaxisorp 96孔微孔板中加入50gL對照抗原或NiV抗原：第1列、第3列、第5列、第7列、第9列、第11列的孔中加入NiV抗原，在第2列、第4列、第6列、第8列、第10列、第12列的孔中加入對照抗原，然后37℃振蕩1h，也可以在4℃過夜。

③封閉ELISA板。用含有0．5％tween-20的PBS沖洗ELISA板3次，再加入含有5％脫脂奶粉的PBS，37尼帕病毒病振蕩30min，封閉ELISA板。

④加被檢血清。用PBST沖洗板3次，并加入100uL處理的血清。在酶標A蛋白對照孔和底物對照孔中加入含有5％卵清蛋白和5％脫脂牛奶的PBS。37℃靜置1h后用PBST沖洗3次。

⑤在含有1％脫脂牛奶的PBST中稀釋酶標A蛋白，稀釋為原來的1／3000。仔細混勻后在每個孔（除底物對照孔）中加入100uL。在底物對照孔中加入100uL含有1％脫脂牛奶的PBST，37℃靜置1h后用PBST沖洗3次。

⑥準備底物溶液。在10ml 0．05mol／L磷酸緩沖液中溶解一片四甲基聯苯胺（TMB，1片lmg，Sigma公司， 目錄號T 3405），并加入2uL新鮮的H202。每孔中加入100uL底物溶液，在18～22℃孵育10min，后每孔加入100uLlmol／L的硫酸，終止反應。

⑦以底物對照孔為空白對照，測定各個孔的450nm處的OD值，并計算每一份血清樣品的在NiV抗原包被孔OD值（ODNiV和對照抗原包被孔中OD值（ODCON）之比（OD比）。

⑧結果判定：①OD比>2．0，并且ODNiv>0．2，判為陽性；②OD比>2．0，并且ODNiv＜0．2，判為陰性；③OD比在2．0和2．2之間的應該判為疑似；④疑似和陽性樣品應該用VNT進行進一步檢測。