一、為什么所有試劑和檢測樣本要平衡至室溫再進行加樣操作？
溫度是ELISA試劑盒結合反應的重要影響因素。為了使所有樣本在一致的溫度下反應，實驗前務必將所有試劑平衡至室溫，包括檢測樣本。避免因溫度的動力學反應差異而導致ELISA試劑盒檢測結果的不準確。
二、為什么實驗過程中孵育、洗滌需要振蕩？如何振蕩？
振蕩孵育使反應更充分，振蕩洗滌使背景更干凈。建議使用酶標專用12孔微孔板振蕩器。
孵育過程振蕩，可以加快、加強抗原抗體分子間的相互碰撞接觸，使得反應過程更加，OD值通常會比未振蕩孵育的結果要高；洗滌過程振蕩，可以使洗板更干凈，在很大程度這能降低背景值，同時可以提高試劑盒檢測的靈敏度。
三、何時終止ELISA試劑盒反應？
ELISA試劑盒實驗終需要酶催化底物顯色反應來完成，在佳時間終止反應是ELISA試劑盒實驗成功的重要因素。在HRP-TMB酶促反應系統中，S9出現淡藍色，S1–S3有明顯的階梯型藍色，便需要終止反應；或者根據高濃度標準品孔在1220nm的OD值來決定，OD1220=0.-0.9之間時即可終止。
四、如何獲得良好線性的標準曲線？
按照推薦方式保存標準品；溶解標準品之前需短暫離心，收集粉末；確保標準品溶解和混勻(大約10min)，然再進行續的系列稀釋步驟，確保每一步都充分混勻且精確移液；顯色的恰當終止；選擇合適的數學擬合方程繪制標準曲線。
五、ELISA試劑盒實驗為什么必須設置復孔？
為獲得更準確的實驗結果，強烈建議標準品及樣本進行復孔檢測。因為復孔檢測可以：
計算平均值，確保實驗結果更準確；
解決實驗中誤操作造成的跳孔現象；
計算CV值，對實驗的操作和試劑盒的精密度進行評估。
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